研究背景

種々の細胞の協調により、心臓全体が電気的にうまく統御され、収縮−弛緩をリズミカルに繰り返すことができる。心筋細胞のモデリングには、パッチクランプ法のデータを用いることができる。パッチクランプはin vivoで単分子の挙動を測定できるため高精度のモデルを構築できる。

私たちは、京都大学の野間昭典教授のグループによりすでに構築されているKyoto modelをE-CELL System上に構築し、イオンチャネルの電気生理学的要素、筋小胞体のCa²⁺ハンドリング、筋収縮、エネルギー代謝を実装することにより、昨年度までに心臓収縮に大きく関与する心室筋細胞の特徴的な活動電位のシミュレーションを実行する環境を得た。

心筋虚血とATP感受性K^＋チャネル

ＡＴＰ感受性K^＋チャネル(以下、KATPチャネル)は、心筋虚血性変化に非常に関連のあるイオンチャネルである。このチャネルは酸素欠乏により、細胞内ＡＴＰが減少すると、活性化されるという特性がある。そのために心筋細胞の静止膜電位レベルが過分極し、膜抵抗が減少するとともに、心筋活動電位の著明な短縮が起こる（以下、APD）。しかし、虚血初期には心筋活動電位の短縮が起こるが、静止膜電位は脱分極する。この時点では心筋の細胞内ATPはまだ減少していないともいわれているので、組織の酸性化や局所でのK^＋イオンの蓄積などがこれらの変化の主たる役割を果たしているのかもしれない。実際、心筋虚血のどの時点でATP感受性K⁺チャネルが活性化されるかは明確ではなく、また、先行する軽い虚血がその後に起こる大きな虚血による障害を減少させるという現象（preconditioning）に、KATPチャネルが関与しているといわれている。

目的　

�@KATPチャネルは京都モデルでは、正常な心筋細胞は2333個中、１個分位の電流しか発生させないため、生理学的環境下では活動電位にほとんど影響を与えないチャネルである。ほぼ正常な状態では機能してないのにこれほど発現しているのはなぜなのか。

�AAPDには細胞内Na^＋濃度増加により活性化されるK⁺チャネル（IKNa）の開口とKATPの活性化が関与しているらしいのだが、その発生機序とはいかなるものなのか。

�BKATPチャネルはミトコンドリアにより産生されたATPの需要に直接関係するチャネルのひとつであるが、他にSRのCa²⁺-ATPaseやNa⁺/K⁺ pumpのNa-KATPaseがあげられ、これらのチャネルとKATPチャネル活性化との相関はいかなるものなのか。

�CATPを正常量より減少させていくことにより、モデルでKATPチャネルの活性化を再現することはできるか。また、ATP減少度はKATPチャネルの活性化にどのような影響を及ぼすであろうか。以上の疑問を解決すべく、KATPチャネルがどの時点でどのように活性化され、その生理的な役割が心筋虚血傷害の軽減にどのような効果をもたらすのか、シミュレーション解析を行い、その解明を目指す。

結果 (1)

Figure1: Membrane potential by CC method

ATPの減少に伴うMembrane potentialの挙動の変化を示す。Current clamp methodによる心室筋の活動電位である。Membrane potentialは０相、１相は正常な状態とほぼ変化なく、２相からずれ始め、３相で再分極した時には、正常な細胞よりも早く過分極し、活動電位の短縮が見られる。ATP濃度が４e+3ｍＭの時の活動電位は正常濃度の時と一致し、3e+3ｍＭにした時はAPDが起こっているので、その間にAPDが起こるか起こらないかの境界があると考える。

Figure2: The current of KATP channel by VC method

KATPチャネルのVoltage clamp methodによる電流を示す。ATP濃度が1e+3ｍMの時の電流量はnormal cellの約30倍であることがわかった。ATP濃度の減少により、KATPチャネルが活性化したことがわかる。

Figure3: The current of Na⁺/K⁺ pump by VC method

Na⁺/K⁺ pumpの電流量の比較を示す。ATP濃度が減少するに伴い、Na⁺/K⁺ pumpの電流量が増加していくことがわかる。

Figure4: The current of SR Ca²⁺Uptake by VC method

SR Ca²⁺Uptakeの電流の比較を示す。0.1msecの時のATP濃度とSR Ca²⁺Uptake チャネルの電流を表に示す。このようにチャネル電流量はATP濃度の減少に伴い増減する傾向は見られなかった。

ミトコンドリア・エネルギー代謝経路モデル

Figure5: モデルに組み込まれている電気生理学的なミトコンドリアの代謝作用の過程、及びそれらの相互作用の構造図

心筋細胞・ミトコンドリアにおける、生体エネルギー特性の調節についてのthermokineticなモデルである[3]。

モデルはTCA回路、酸化的リン酸化およびミトコンドリアのCa²⁺の取り込み、電子伝達について実装した。

本モデルは、ミトコンドリアの膜電位、Ca²⁺濃度、NADH、ADPおよびTCA回路の中間物質の時間変化率を12の微分方程式で表現している。代謝作用の抑制、アデニン・ヌクレオチドトランスロケータ−、及び、Ca²⁺の変化等においてミトコンドリア内の働き、相互作用の予測を可能とする。尚、モデルは定性的に半定量的にミトコンドリアの生物エネルギ-学、Ca²⁺のダイナミクス、及び呼吸調整に関する実験のデータを再現している。

今回、このモデルをE-CELL System上に移植した。尚、現段階において、本モデルは既に構築した心筋細胞モデルとの連結は行っていない。

実装結果

以上に述べた点を踏まえて、E-CELL System上にて、心筋細胞、ミトコンドリアにおけるエネルギー代謝経路の実装を行った結果、ミトコンドリアにおける、TCA回路、酸化的リン酸化およびミトコンドリアのCa²⁺の取り込み、電子伝達の各物質において定常状態を達成した。それらの値を以下に示す。

Table1: Steady State Parameters

考察 (2)

今回、消費を相補するATP産生モデルとして、酸素や糖分を受け取ってATPを産生する、解糖系、TCA回路、酸化的リン酸化経路を中心としたエネルギー代謝経路の実装を行った。今後、既にE-CELL System上に構築したKyoto modelに連結し、ATPが産生され、消費される一連の過程の表現、心筋細胞内が虚血状態に陥る過程やその状態の再現、また、それに伴う細胞内の諸要素の機能変化や相関関係を検証するためのシミュレーション解析を行っていく上で、今回の実装は大きな意味を持つ。

展望

今回、本モデルは既に構築した心筋細胞モデルとの連結は行っていない。今後、基質供給、代謝作用の抑制、およびCa²⁺の変化に関しての振る舞いを検討していく。さらに、システムの本質的なコントロール特性に対する新たな見識の獲得を可能とするような心筋細胞とミトコンドリアのエネルギー代謝が一体になったモデルの構築を目指す。

参考文献・参考URL