E-Cellシミュレーションシステムによる不応期メカニズムの解明

 

慶應義塾大学大学院　政策・メディア研究科

河合　勝也

1          概要

　これまで心筋グループでは、内藤泰宏講師が中心となってE-Cellシミュレーションシステム上に精細な心筋モデルを構築してきた。そのモデルは徐々に完成度が上がりつつあり、最近では実際の実験とほぼ同じような値を得られるようになってきている。

今回の研究では、そのモデルに薬物効果による状態変化を再現しうるような改修、具体的には代表的な薬物メカニズムの仮説であるModulated Receptor仮説、およびGuarded Receptor仮説のモデルを追加し、それによって不応期のメカニズムの解明を行えるようにするべく改修を行った。

なお、Guarded Recptor仮説に関しては従来から提唱されてきたモデルであるWoodhull Modelを、Moduated Receptor仮説に関しては独自に考案した式を取り入れ、実際に不応期延長が発生するかを確認した。

 

2          序論

2.1　研究の背景

　今日、心臓における不整脈（心室頻拍、心室細動、心房粗細動等）の治療法に関する研究が様々なアプローチで行われている。これらは、主に薬物療法と非薬物療法に分けられる。

このうち薬物療法に関しては各薬物の効果・効能について研究が進められているものの、細胞内における薬物の細かい機序については、まだ仮定について論議されているに留まっている状態である。

 

　2.2　研究の目的

　私が所属する心筋チームでは、E-Cellによる心筋のモデリングを行っている。これは、心筋細胞に存在するイオンチャンネルおよびトランスポータの働きを電気生理学に基づき忠実に再現したシミュレーションモデルである。現在は心室筋および洞房結節のモデル化を行っているところであるが、これらはパッチクランプ法によって測定された実際の心筋細胞の計測結果と、ほぼ一致した結果が得られるまでになっている。

　そこで、今回不応期のメカニズムを解析するにあたっては、このモデルを拡張して薬物効果の機序を組み込み、それをもって不応期のin silico実験を行えるようなシミュレーションモデルを作成することを目的とした。

 

3          不応期について

すべての細胞では、細胞膜をはさんで様々なイオンが不均一に分布しているが、これらの状態を維持することで大きなエネルギー（化学物質の拡散による力とイオンによる電気的な力）が蓄えられている。この蓄えられたエネルギーから電気を作り出すのが、イオンチャンネルである。

 

　イオンチャンネルはほとんどすべての細胞に存在し、細胞内外の種々なイオンの働きの調節を行っている。

　これらのイオンチャンネルの働きが様々に組み合わさって、細胞膜上において複雑な電位の変動を生み出している。

 

　多くの細胞では外部からの電位の刺激を受け、それに対するリアクションを起こすが、この電位の刺激を受けたさいに、その刺激に対する反応を行えなくなる期間が存在する。それが不応期と呼ばれる期間である。

 

この不応期は、絶対不応期と有効不応期の二つに分けられる。それぞれの特徴を表３．１に示す。

 

表３．１　不応期の特徴

 

特徴

絶対不応期

・     強い刺激を受けても新たな興奮が起こらない

・     時間長さにして約200ms

有効不応期

・     強い刺激に対してのみ興奮が生じる

・     薬物によって期間の延長、短縮することが確認されている

 

 

 

　不応期の詳しいメカニズムについてはほとんど解明されていないが、表３．１にも記述したように有効不応期の時間長さが薬物によって短縮・延長することが実際の細胞における実験によって知られている。

 

この期間の変動をコントロールすることは、心室細動、頻脈などの心臓興奮の異常状態を抑制するために重要であり、不応期のメカニズムの解明が出来ればこれらの心臓異常に関する治療の一助となると思われる。

 

 

4          薬物効果による不応期の延長について

　前章において記述したように、不応期は薬物によって影響を受ける。

なぜ薬物によって不応期が影響をうけるかというと、薬物は最終的にイオンチャンネル内部に存在する薬物受容体に結合し、その結果としてイオンチャンネルの本来の機能が阻害されるためである。ただ、受容体に結合するまでの経路はまだ証明された説はなく、現在いくつかの仮説が提唱されている状況である。

そのうちの代表的なものは

 

・     Guarded receptor仮説

・     Modulated receptor仮説

 

の2つである

Guarded receptor仮説の特徴としては、その効果が現れにくいこと、主に電位に依存する形となることがあげられる。また、Modulated receptor仮説の特徴としては効果が現れやすいこと、主に頻度に依存することがあげられる。

なお、これらの仮説はイオン通過の阻害をするという前提にたっており、イオンチャンネルのゲート開閉を阻害することはないものとしている。

それぞれの仮説におけるメカニズムについては次で説明する。

　

4.1　Guarded receptor仮説

　この仮説では、細胞膜であるリン脂質二重層を経由して薬物の侵入およびイオンチャンネルの受容体への結合が図られる。

　受容体との結合に際して、一旦リン脂質二重層を経由するために、薬物投与後すぐにその効果が現れることはない。細胞膜内に侵入するには時間がかかるが、その時間は細胞膜内外の電位差によって大きく影響をうける。これが電位依存性となる。

また、同様の理由で細胞外から薬物が除去されてもすぐに影響が消えることはない。

　

4.2　Modulated receptor仮説

　この仮説では、イオンチャンネル内部にある受容体に薬物が直接入り込みイオンチャンネルの受容体への結合が図られる。

　Guarded Receptor仮説と異なり、受容体との結合に際して余計な経路が存在しないため、薬物投与後すぐにその効果が現れる。ただし、そのためにはイオンチャンネルが開くことが条件であり、開かなければ薬物が侵入・結合することはない（図4.3の状態遷移図を参照）。逆にいうと、開けば開くほど侵入・結合して働きを阻害する。これが効果の度合いがチャネルの開く頻度に依存（頻度依存性）するという所以である。

また、同様の理由で細胞外から薬物が除去されると早く影響が消える（この場合もチャンネルが開くことが条件で、開かなければ薬物は受容体に結合したまま保持される）。

なお、頻度依存性はｐHの影響を大きく受けることがわかっており、これは、ｐHによって非乖離性をみせる薬物などが存在するためと言われている。また、疎水性であるか親水性であるかにより異なる経路をとることもある。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


5          薬物効果の組み込み

　5.1　Guarded Receptor仮説の組み込み

　Guarded Receptor仮説については、Woodhull Modelと呼ばれるWoodhullによって提唱されたシミュレーションモデルがあるので、それを組み込むこととした。ただし、このモデルでは薬物投与の一定時間後のモデルであり、薬物投与からイオンチャンネルに影響を与えるまでの過渡状態については再現できない。

　Woodhull Modelの式については、図5.1で説明する（参考文献13から引用）。

 

 

ある薬物Dがその受容部位Rと作用する状態は下式のように表される。

 

K1

D+R　⇔　DR

K-1

 

Kd＝K1/K-1（K1は結合の2次速度定数、K-1は解離の一次速度定数）

 

Kdは平衡定数をさす。平衡状態における受容部位にどのくらい薬物が結合しているかは、

 

ｙ＝１／（１＋Kd/[D]）

 

と表される。たとえば、薬物濃度［D］がKdと等しいときには５０％の受容部位に薬物が結合していることになる。

［Ｄ］を突然変化させると新しい定常状態に移行していくが、その移行する時定数τは

 

τ＝1/(k-1+[D]＊k1)

 

で表される。

図5.1　Woodhull Model

 

この処理は、E-Cellの環境ファイルから濃度を与えることで需要部位への結合を指定することができるようにした。なお、現時点で影響をうけるチャンネルとしてNaチャネルおよびL型Caチャネルに組み込みを行った。

 

5.2　Modulated Receptor仮説の組み込み

　Modulated Receptor仮説の組み込みに関しては、頻度依存性を再現するモデルが見つからなかったため、新たな式の検討を行った。

 

　頻度依存性の影響下にある相対電流の変動例を図5.2に示す。なお、この曲線は計測結果の近似曲線であり、実際の測定値がかならずこの曲線に乗るわけではない。

 

図5.2　リドカイン環境下での相対電流

 

変動例から考察した項目を以下にまとめる。

 

・     グラフは逆対数関数に似た形状を示す（ただし、時間0において初期値１とする）。

・     低周波数時に変動が縮小するのは、ブロックからのリカバリが同時に存在しているためと仮定する。

・     初回の刺激を線でつなげていくと、対数関数に似た曲線が描かれる。（図上で赤い破線で示した曲線）これがリカバリの曲線であると仮定する。

・     リカバリは薬物毎に特有である

 

以上から、この曲線の計算式として相対電流yを求める式をたてた。なお、シミュレーションシステムの処理の関係上、微分方程式としている。

 

ｙ＝bind/((X+diff)*log(1/e))＋recovery/((x+diff)*log(e))

（初期値は１とする）

 

なお、第一項は薬物の結合を示す項であり、bindは刺激頻度に依存する。第二項は薬物の乖離を示す項でありrecoveryは薬物に依存するものと定義する。diffは当初１で固定していたが、それだと高刺激頻度における傾きが表現できなくなるため、刺激頻度によって変動するものとした。

 

　この式を使って、1〜４Hzを想定して描いたグラフが図5.3である。このときのパラメータは表5.1に示す。


 


図5.3　相対電流図　

 

 

表5.1　パラメータ一覧

 

Binary

Recovery

Diff

１Hz

0.12

0.11

0.1

２Hz

0.13

0.11

0.07

４HZ

0.145

0.11

0.04

８Hz

0.15

0.11

0.015

 

表5.1を元にして、パラメータ決定の目安とするためのグラフを起こした（図5.4、5.5参照）。基本的に曲線の延長上の点と、計算に必要な周波数から必要なパラメータが推測できる。

たとえば、10Hzで刺激を与える場合、図からDiff：0.012、Bind：0.152と推測できる。

 

図5.4　diff値

 

図5.5　bind値

 

なお、この式におけるパラメータの検証用（実測値との比較）に数学ソフトウェアであるMathcadを利用したシートを作成した。今回、実験に際して利用したパラメータはこのシートを利用している。

 

この処理は、E-Cellの環境ファイルから３つのパラメータを与えることで阻害を指定することができるようにした。なお、現時点で影響をうけるチャンネルとしてNaチャネルおよびL型Caチャネルに組み込みを行った。

 

6          結果

　今回作成した式を心筋のシミュレーションモデルに組み込んで実験を行った。実験における条件を表6.1にまとめた。

 

表6.1　シミュレーション条件

薬物

リドカイン

Na＋チャネルの働きを抑制する

状況

薬物投与直後

 

Bindパラメータ

0.13

 

recoveryパラメータ

0.11

 

Diffパラメータ

0.07

 

初回刺激時間

0.05秒

 

刺激周波数

2Hz

 

 

それによるシミュレーション結果を図6.1〜図6.2に示す。

 

図6.1　membrane

 

図6.2　Na＋

 

図6.2を見るとわかるように、薬物投与後ということで、ピークの電位が徐々に上がっていくのが観察できる。また、図6.1から、Na+チャネル電位の影響を膜電位が受けていないこともわかる。

そこで、表6.2の条件で薬物有無によってどのような違いが現れるかを行った結果が図6.3〜6.4である。

 

表6.2　シミュレーション条件

薬物

リドカイン

Na＋チャネルの働きを抑制する

状況

薬物投与直後／なし

 

Bindパラメータ

0.15／なし

 

recoveryパラメータ

0.11／なし

 

Diffパラメータ

0.015／なし

 

初回刺激時間

0.05秒

 

刺激周波数

8Hz

 

 

 

図6.3　membrane

 

図6.4　Na＋

 

今回、８Hzで外部刺激を入れたことによって、膜電位が収束する前に再度刺激を入れる状況を作った。

 

図6.3を見るとわかるように180ms時の外部刺激に対して薬物がない場合のよりもわずかに早く収束しているが、刺激を入れている期間がまず間違いなく絶対不応期の期間であるので、これは誤差とみなしてもいいと思われる。

 

次に相対不応期期間に刺激を与えた実験を行った（条件は表6.3参照）。結果を図6.5から6.6に示す

 

表6.3　シミュレーション条件

薬物

リドカイン

Na＋チャネルの働きを抑制する

状況

薬物投与直後／なし

 

Bindパラメータ

0.14／なし

 

recoveryパラメータ

0.11／なし

 

Diffパラメータ

0.03／なし

 

初回刺激時間

0.05秒

 

刺激周波数

6.25Hz

 

 

 

図6.5　membrane

 

図6.6　Na＋

 

図6.5を見ると、リドカインによる不応期の延長によって外部刺激の影響が抑えられているのが確認できる。このことから不応期の延長に関しては組み込むことができていると思われる。

 

 

7          考察

最後に、実験下の心筋でしかありえないが、外部刺激周波数を10Hzに上げた特殊条件（表7.1参照）での実験を行った。結果を図7.1〜7.2に示す。

 

表7.1　シミュレーション条件

薬物

リドカイン

Na＋チャネルの働きを抑制する

状況

薬物投与直後／なし

 

Bindパラメータ

0.152／なし

 

recoveryパラメータ

0.11／なし

 

Diffパラメータ

0.012／なし

 

初回刺激時間

0.05秒

 

刺激周波数

10Hz

 

 

 

図7.1　membrane

 

図7.2　Na＋

 

　結果をみると、3度目の刺激が８Hz時よりも周期が短くなっているために先のグラフと比較するとNa＋チャネルの不活性化からの回復が見て取れる。ただ、薬物環境下において250ms付近でのグラフの傾きがあきらかに変動している個所がある。

　図7.2においても、その付近での波形（とくにピーク時間）があきらかにずれているので、今回導入した式に何らかの問題がある可能性もある。この点については今後の検討課題としていきたい。