研究背景

種々の細胞の協調により、心臓全体が電気的にうまく統御され、収縮−弛緩をリズミカルに繰り返すことができる。心筋細胞のモデリングには、パッチクランプ法のデータを用いることができる。パッチクランプはin vivoで単分子の挙動を測定できるため高精度のモデルを構築できる。

私たちは、京都大学の野間昭典教授のグループによりすでに構築されているKyoto modelをE-CELL System上に構築し、イオンチャネルの電気生理学的要素、筋小胞体のCa²⁺ハンドリング、筋収縮を実装することにより、心臓収縮に大きく関与する心室筋細胞の特徴的な活動電位のシミュレーションを実行する環境を得た。

目的　

本実験の目的は、心室筋細胞モデルを用いて、虚血状態を仮定し、Na⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルを変化した状態において、細胞内Ca²⁺濃度、及び、 心収縮能力が保持されるという心筋保護作用がどのような条件の下に現れるのかについて観察し、心筋が保護されている状態を細胞レベルで再現し、細胞内Ca²⁺の動態を中心に解析することにある。

手法　

1. Na⁺/Ca²⁺ exchangerの発現レベルを変化

遺伝子発現レベルを10〜300%の範囲とし、10%間隔で30条件設定する。

2. 細胞内ATP濃度を正常状態より約50%減少して虚血状態を想定

通常、心室筋細胞モデルでは細胞内ATP濃度を4.663 mMとしているが、50%減少した2.3315 mMを虚血状態と仮定した。

3．細胞内Na⁺濃度を5倍に増加し、細胞内Na＋濃度の過剰蓄積を考慮

細胞内Na⁺濃度の過剰蓄積レベルを1〜8倍の範囲とし、1倍間隔で8条件設定する。 以上により、Na⁺/Ca²⁺ exchangerの発現量を30条件、細胞内Na⁺濃度の過剰蓄積量を8条件の組み合わせで、計240条件の実験を行う。

心筋保護作用の評価方法　

1） 細胞内Ca²⁺濃度の比較

Na⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルを変化することによって、Ca²⁺イオンの動態に影響があることを予測し、実験結果を細胞内Ca²⁺濃度を中心に観察する。また、細胞内Ca²⁺濃度は収縮期と拡張期により異なるが、ここでは大きな増減の変化をもたない安定した値を採取し、拡張期の細胞内Ca²⁺濃度を評価関数とする。

2） 心収縮力の比較

本実験に用いた心室筋細胞モデルにおいては、収縮単位であるサルコメアの長さ（Half SL）によって心収縮能力を評価することができるため、HalfSLを心筋保護作用の評価関数とすることとした。

結果 (1)

Figure2: x軸が細胞内Na＋蓄積量（倍）, y軸がNa⁺/Ca²⁺exchangerの発現量（%）, 心筋保護作用の評価関数として, 細胞内Ca²⁺濃度を加えたグラフ　　

黄色の領域が細胞内Ca²⁺濃度が正常に保持された心筋保護作用領域。虚血状態時、細胞内Na⁺イオンの過剰蓄積レベル、1〜8倍すべての条件において、細胞内Ca²⁺濃度が正常状態の100%に近い値を示すNa⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルの条件があることがわかった。この条件は、細胞内Na⁺イオンの過剰蓄積レベルが1倍から8倍に増加するにつれて、Na⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルも増加する傾向がみられた。

Figure3: x軸が細胞内Na⁺蓄積量（倍）, y軸がNa⁺/Ca²⁺exchangerの発現量（%）, 心筋保護作用の評価関数として, Half SLを加えたグラフ

黄色の領域がHalf SLが正常に保持された心筋保護作用領域。虚血状態において、Half SLが正常状態に近い条件は、細胞内Na⁺イオンの過剰蓄積レベル、1〜8倍すべての条件において、異なったNa⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルで存在した。この領域は、細胞内Ca²⁺濃度が正常に近い状態で保持された領域（Figure2）と同じ条件下（細胞内Na⁺濃度の過剰蓄積レベル、Na⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベル）で観察された。

考察

虚血状態時、細胞内Na⁺イオンの過剰蓄積レベル、1〜8倍すべての条件において、細胞内Ca²⁺濃度が正常状態の100%に近い値を示すNa⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルが存在することがわかった。これは、虚血状態と各細胞内Na⁺イオンの過剰蓄積量の程度に応じて、もっとも適した遺伝子発現レベルのNa⁺/Ca²⁺ exchangerのreverse modeとforward modeの活性化が効率よく細胞内外のCa²⁺イオン交換を行ったことにより、正常状態の細胞内Ca²⁺濃度に近い状態に至ったと考える。

また、今回の実験により、設定した虚血状態の程度と各細胞内Na⁺イオンの過剰蓄積レベルに対して、正常状態に細胞内Ca²⁺濃度を保持するNa⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルは80〜230％の範囲内であることがわかった。この正常状態に細胞内Ca²⁺濃度を保持するNa⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルは、細胞内Na⁺イオンの過剰蓄積レベルが1倍から8倍に増加するにつれて、増加する傾向がみられた。これは、細胞内Na⁺イオンの過剰蓄積量が増加すればするほど、Na⁺/Ca²⁺ exchangerのreverse modeが活性化し、細胞内Na⁺イオンを細胞外に汲み出そうと働くが、同時に細胞内にCa²⁺イオンが取り込まれ、細胞内Ca²⁺濃度が増加してしまうため、Na⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルを上昇し、forward modeを活性化する必要があるためだと考える。

その一方、細胞内Na⁺イオンの過剰蓄積レベルが1〜3倍の条件において細胞内Ca²⁺濃度が保持されるNa⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルは100%以下であり、Na⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現を抑制した方が細胞内Ca²⁺濃度が正常であることが示された。これは、細胞内Na⁺イオンの過剰蓄積レベルが低いことにより細胞内Na⁺濃度の増加が少ししか見られないために、Na⁺/Ca²⁺ exchangerのreverse modeよりもforward modeが作用し、主に細胞内に細胞外Na⁺イオンを流入し、細胞内のCa²⁺イオンを細胞外に放出する動きをとるために細胞内Ca²⁺濃度が減少する傾向をふせぐために、Na⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルをおとす必要がある。よって細胞内Na⁺イオンの過剰蓄積レベルが1〜3倍の場合に細胞内Ca²⁺濃度が保持するためには、Na⁺/Ca²⁺ exchangerの遺伝子発現レベルが100%以下に抑えられると考える。