2005年度　森泰吉記念研究振興基金　成果報告書

トランスクリプトームとメタボロームデータを用いた酵母の硫黄代謝経路の制御

井元淳
慶応義塾大学　政策・メディア研究科　修士課程1年

1. 要旨 2. 序論 3. 実験手法 4. 結果 5. 議論 6. 謝辞 7. 参考文献

1. 要旨

　ビールの鮮度は酵母が発酵中に生産する亜硫酸が抗酸化剤となることで保たれるため，鮮度を維持するには酵母による亜硫酸の生産量を増加させることが有効な手段となる．しかし亜硫酸は，異臭の原因となる硫化水素に容易に変化する．そのため，亜硫酸だけを増加させるには代謝経路全体の制御が必要となる．
　本研究の目的は，細胞内代謝物を一斉に測定することができるキャピラリー電気泳動-質量分析計(Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry; CE-MS)を用いたメタボローム解析とDNAマイクロアレイ解析によって酵母の硫黄代謝経路における代謝物量と遺伝子発現量の経時変化を解析し，この代謝経路を制御している物質を特定することである．
　そこで今学期は，亜硫酸が生成される硫黄代謝経路の5遺伝子をそれぞれノックアウトした遺伝子破壊株(Δmet2，Δmet17，Δhom3，Δhom6，Δthr1)と野生株SYT001について，メタボローム解析とDNAマイクロアレイ解析を行い，転写産物レベル，メタボロームレベルの両面から比較した．
　この結果から，HOM3，HOM6，THR1は遺伝子破壊の影響が経路全体に及んでいるのに対し，MET2，MET17は遺伝子破壊の影響が少なく代謝物質の濃度に大きな変化がないということが分かった．また，HOM6とTHR1はスレオニンによるフィードバック調節に関与していることが示唆された.

Keywords：CE-MS；Metabolomics；Transcriptomics；酵母；遺伝子破壊

2. 序論

　メタボロームの網羅的測定は，遺伝子発現や酵素活性との関係を明確にすることによって細胞機能を解明することができるポストゲノム研究の重要な要素であると考えられている．
　メタボローム解析に使用される手法には様々なものがあるが，ほとんどが陽イオン性か陰イオン性の低分子である細胞内代謝物を網羅的に直接定量分析することはできない．そこで，イオン性化合物の分析に適したCE-MSを用いて細胞内代謝物を一斉に測定する手法が注目を浴びている．この分析法は，キャピラリー電気泳動により分離後，質量分析計で検出する．この方法の優れている点は，同一条件でほとんどのイオン性化合物を質量分析計に導入し検出できることである(Soga and Heiger, 2000).
　ビール酵母における研究は多くの酒類会社がDNAマイクロアレイ解析技術を用いて，網羅的な遺伝子発現レベルでの解析を行ってきた．酒類の重要な香味成分の多くは，酵母の発酵中に作られる．果実様の香りを出し好ましいと感じられる酢酸イソアミル等の酢酸エステルや，腐った卵のような臭いがし好まれない硫化水素，濡れた段ボールのような臭いである酸化臭を抑える抗酸化剤として働く亜硫酸等の代謝産物がある．特に抗酸化剤である亜硫酸は鮮度を保つための重要な成分となっており，ビールの品質に大きく影響する．そのため多くの酒類会社は硫黄代謝経路の研究を進めており，DNA組み換え技術を用いた解析(Hansen J et al., 1996)やDNAマイクロアレイ解析技術を用いた遺伝子発現レベルでの解析(Olesen K et al., 2002)が行われている．しかし遺伝子組み換え技術はビールの実生産には利用できないため，遺伝子組み換え技術を用いず硫黄代謝経路を制御する手法の確立が望まれている。
　本研究では，香味成分，特に硫化水素，亜硫酸に注目し，遺伝子発現レベルと代謝産物レベルで解析し，発現抑制を受けているところはどこか，代謝物を生成するパスウェイのどこにボトルネックがあるのか，フィードバックのキーとなる物質は何かを読み取り，亜硫酸を高生産し，硫化水素を低生産する菌株の取得を目的とする．
　そこで今学期は，亜硫酸が生成される硫黄代謝経路の5遺伝子をそれぞれノックアウトした遺伝子破壊株(Δmet2，Δmet17，Δhom3，Δhom6，Δthr1)と野生株SYT001について，メタボローム解析とDNAマイクロアレイ解析を行い，転写産物レベル，メタボロームレベルの両面から比較し，目的の菌株取得の際に注目すべき物質を読み取る．

3. 実験手法

3.1 菌株と培養条件

　測定には実験室酵母としてSaccharomyces cerevisiae SYT001，SYT001からMET2，MET17，HOM3，HOM6，THR1をそれぞれノックアウトした遺伝子破壊株Δmet2，Δmet17，Δhom3，Δhom6，Δthr1を使用した．ただし，Δthr1はマイクロアレイ解析は行わなかった.
　培養は，0.5% Yeast Extract, 0.3% polypeptone, 0.1% Ammonium Sulfate，10% Glucoseの合成培地で20℃ ，2Lスケールの嫌気撹拌培養を行った．Δmet2，Δmet17は0時間，6時間，24時間，48時間，72時間，96時間の6ポイントで，Δhom3，Δhom6，Δthr1は0時間，6時間，24時間，48時間，72時間の5ポイントでサンプリングした．1度のサンプリングで4サンプルずつ得た．
　実験はSYT001(1)，Δmet2，Δmet17を用いた回，SYT001(2)，Δhom3，Δhom6を用いた回，SYT001(3)，Δthr1を用いた回の３回に分けて行った.

3.2 CE-MS分析条件

陽イオン性物質

　物質の分離には1Mの蟻酸を電解液として満たしたフューズドシリカキャピラリー(50μm i.d. × 全長100cm)を使用した．試料は50mbarの空気圧で3秒間，3nLを注入した．電圧は＋30kVに設定した．キャピラリーは20℃，サンプルトレイは5℃未満に保った．シース液には5mMの酢酸アンモニウム(50% (v/v) MeOH)を用い，10μL/minで送液した．ESI-MS(Electro Spray Ionization Mass Spectrometry)はポジティブイオンモード，キャピラリーの電圧は4000Vに設定した．窒素ガスは300℃のヒーターで加熱し，10L/minで供給した．

陰イオン性物質

　物質の分離には50mMの酢酸アンモニウム(pH8.5)を電解液として満たし，内表面が陰イオンポリマーでコーティングされているNacalai Tesque社製SMILE(+)キャピラリー(50μm i.d. × 全長100cm)を使用した．試料は50mbarの空気圧で30秒，30nLを注入した．電圧は -30kVに設定した．ESI-MSはネガティブイオンモード，キャピラリーの電圧は3500Vに設定した．その他の条件は陽イオン測定と同じにした．

3.3 CE-MS測定対象物質と代謝経路図

　CE-MS測定対象とした代謝経路は，硫黄系アミノ酸生成経路(図1)である．硫黄系アミノ酸生成経路では酒類の重要な香味関連成分である亜硫酸と硫化水素が生成され，ビールの香味に直接影響する経路である．硫黄系アミノ酸生成経路はフィードバック，及び転写因子により制御されている(Thomas D. and Surdin-Kerjan Y., 1997)．

図1. 測定対象経路

図は，硫黄系アミノ酸生成経路を示したものである．硫黄系アミノ酸生成経路はフィードバック，及び転写因子により制御されている(Thomas D. and Surdin-Kerjan Y, 1997)．

CE-MSによる測定対象物質を表1に示した．亜硫酸，硫化水素量は各々高速液体クロマトグラフィー，ガスクロマトグラフィーにより測定した．

表1. 測定対象物質
＠陰イオン
化合物名	m/z	精密質量数
4-aspartate semialdehyde*	118	117.103
MES(IS)	194	-
homoserine phosphate*	198	199.098
trimesate(IS)	209	-
4-aspartyl-phosphate*	214	213.081
3'-phospho-5'-adenylylsulfate*	506	507.264

＠陽イオン
3-aminopyrrolidine(IS)	87	-
serine	106	105.0426
4-aspartate semialdehyde*	118	117.103
homoserine	120	119.0582
threonine	120	119.0582
cysteine	122	121.0197
aspartate	134	133.0375
homocysteine	136	135.0354
methionine	150	149.051
O-acetyl homoserine	162	161.0688
methionine sulfone(IS)	182	-
homoserine phosphate*	200	199.098
4-aspartyl-phosphate*	214	213.081
cystathionine	223	222.0674
adenosine	268	267.0968
S-Adenosyl Homocysteine	385	384.1216
S-Adenosyl Methionine	399	399.1451
ISは内部標準(Internal~Standard; IS)，m/zは質量電荷比を，*の付いた物質は標準物質が市販されていないことを示す．

4. 結果

4.1 メタボローム解析

　解析には同時にサンプリングした4サンプルの平均値を使用し，野生株との比較にはそれぞれの実験で同時に培養した野生株を使用した．野生株における代謝物の増減と，各遺伝子破壊株における代謝物の増減の相関係数を求めた(表2)．0.7<r<1を強い相関があるとした．

表2. 野生株との相関係数
化合物名	Δmet2	Δmet17	Δhom3	Δhom6	Δthr1
serine	0.8	1.0	0.8	0.9	0.4
homoserine	0.9	1.0	-0.2	0.1	0.4
threonine	1.0	1.0	1.0	0.4	0.3
cysteine	uc	uc	uc	uc	uc
aspartate	1.0	1.0	1.0	-0.7	0.4
homocysteine	uc	uc	uc	uc	0.4
methionine	1.0	1.0	1.0	1.0	0.6
O-acetyl homoserine	uc	0.8	0.8	-0.4	0.7
cystathionine	0.3	0.4	-0.4	0.6	0.5
adenosine	0.9	0.7	0.7	-0.4	-1.0
S-adenosyl homocysteine	0.8	0.9	-0.7	-0.2	-0.8
S-adenosyl methionine	0.9	1.0	-0.0	-0.8	0.2

野生株における代謝物の増減パターンと，各遺伝子破壊株における代謝物の増減パターンの相関係数を示す．野生株との比較にはそれぞれの実験で同時に培養した野生株を使用した．ucは細胞中に含まれなかった，細胞中には含まれていたが検出限界以下だった等の理由により検出されず，従って相関係数が求められなかったことを示す．結果，Δmet2，Δmet17はほとんど代謝物量に変化はなく，Δhom3，Δhom6，Δthr1は代謝物量が大きく変化した．

　メタボローム解析の結果，Δmet2，Δmet17破壊株では，シスタチオニン量が若干変化したものの，他の代謝物にはほとんど影響を与えなかった．
　Δhom3はスレオニンとシスタチオニンが弱い相関を示したのみで野生株と強い相関を示す物質と相関を示さない物質の２種類に分類された．Δhom6は強い相関を示したのはセリンとメチオニンのみで，ほとんど野生株との相関はなかった．
　Δthr1は，野生株と相関がなかったのはアデノシンとS-アデノシルホモシステインだけだったが，強い相関があった物質もO-アセチルホモセリンのみだった．
　硫黄代謝経路の主な物質であるメチオニンはどの遺伝子破壊株でも変化が少なかった．

4.2 亜硫酸，硫化水素生成量

　野生株との変化を確かめるため，亜硫酸生成量，硫化水素生成量それぞれにおける野生株とのユークリッド距離を求めた(図2，図3)．野生株との比較にはそれぞれの実験で同時に培養した野生株を使用した．


図2. 野生株と各遺伝子破壊株との亜硫酸生成量におけるユークリッド距離
横軸は時間(時間)，縦軸は正負の情報を付加したユークリッド距離．Δhom6以外は野生株とほとんど生産量に差はなかった．


図3. 野生株と各遺伝子破壊株との硫化水素生成量におけるユークリッド距離
横軸は時間(時間)，縦軸は正負の情報を付加したユークリッド距離．もともと野生株はほとんど硫化水素を細胞外へ排出しないが，Δthr1以外の遺伝子破壊株では高生産した．Δmet2，Δmet17は培養開始から24時間が経過した時点で野生株との硫化水素生成量が変化したが，Δhom3，Δhom6は逆に24時間が経過した時点で野生株の生成量に近付いた．

図3. 野生株と各遺伝子破壊株との硫化水素生成量におけるユークリッド距離

横軸は時間(時間)，縦軸は正負の情報を付加したユークリッド距離．もともと野生株はほとんど硫化水素を細胞外へ排出しないが，Δthr1以外の遺伝子破壊株では高生産した．Δmet2，Δmet17は培養開始から24時間が経過した時点で野生株との硫化水素生成量が変化したが，Δhom3，Δhom6は逆に24時間が経過した時点で野生株の生成量に近付いた．

　亜硫酸はΔhom6以外は野生株とほとんど生産量に差はなかった．
　硫化水素は, もともと野生株はほとんど硫化水素を細胞外へ排出しないが，Δthr1以外の遺伝子破壊株では高生産した．Δmet2，Δmet17は培養開始から24時間が経過した時点で野生株との硫化水素生成量が変化したが，Δhom3，Δhom6は逆に24時間が経過した時点で野生株の生成量に近付いた．

4.3 DNAマイクロアレイ解析

解析にはアレイ上の同一遺伝子スポットの平均値を使用した．野生株との比較にはそれぞれの実験で同時に培養した野生株を使用した．0.7<r<1を強い相関があるとした．

表3. 遺伝子発現量における遺伝子破壊株と野生株との相関係数
遺伝子名	Δmet2	Δmet17	Δhom3	Δhom6
HOM2	0.4	0.4	0.7	-0.3
HOM3	0.4	0.3	-	-0.1
HOM6	0.7	0.6	0.8	-
MET10	-0.1	-0.7	0.5	-0.7
MET14	0.4	0.5	-0.2	0.3
MET16	0.3	0.0	-0.5	0.6
MET17	0.3	-	0.5	-0.5
MET2	-	-1.0	0.7	0.6
MET3	0.7	0.8	0.7	0.8
MET6	-0.6	-0.7	0.9	-0.2
SAM1	0.8	0.9	-0.6	0.0
SAM2	-0.9	-1.0	0.4	0.8
SSU1	0.7	0.6	-0.6	0.0
MET1*	0.2	0.3	0.1	-0.4
MET12*	0.9	0.9	-0.5	-0.2
MET13*	-0.3	-0.8	0.9	0.1
MET18*	0.6	0.9	0.3	0.8
MET22*	1.0	0.9	0.6	0.1
MET28*	-0.8	-0.6	0.2	0.6
MET30*	0.4	0.4	0.6	0.7
MET31*	0.7	0.4	0.3	0.9
MET32*	0.7	0.5	0.0	1.0
MET4*	0.7	-0.1	0.1	0.6
MET7*	0.9	0.9	-0.8	0.8
MET8*	-0.1	-1.	-0.4	0.9
SAM3*	0.0	-0.1	-0.4	0.6
SAM4*	-0.2	-0.2	0.6	0.6
SSU72*	0.9	0.6	-0.2	0.9

野生株における遺伝子発現量の増減パターンと，各遺伝子破壊株における遺伝子発現量の増減パターンの相関係数を示す．-は該当する遺伝子が破壊されているために相関係数は求められない．*のついた遺伝子は転写因子を示す．

　Δmet2は半数が野生株と同様の発現パターンを示し，残り半数は相関が低いものが多かった．Δmet17はΔmet2に比べて相関が低いものが少なく，正と負の相関を示すパターンに二極化した．Δhom3とΔhom6は経路上の位置はほとんど同じであるにもかかわらず，半数以上が野生株と比較し正反対の発現パターンを示した．
　HOM3を破壊しても下流のHOM2，HOM6，MET2の発現パターンに野生株との差はあまりなかった．HOM6，MET3は他の遺伝子の破壊に影響を受けず，野生株と同じ発現パターンを示した．MET14，MET16，MET17はどの遺伝子破壊株も野生株とは違う発現パターンとなった．Δmet17ではMET2が負に強い相関を示した．Δmet2，Δmet17はSAM1の発現パターンに正の相関がありSAM2に負の相関があった．逆にΔhom3，Δhom6はSAM1の発現パターンに負の相関がありSAM2の発現パターンに正の相関があった．Δmet2，Δmet17は野生株とのSSU1の発現パターンに正の相関があり，Δhom3，Δhom6は相関がなかった．

5. 議論

　メタボローム解析において，Δhom3，Δhom6，Δthr1は代謝物の変化に差が出たが，Δmet2，Δmet17にはほとんど遺伝子破壊の代謝物量への影響はなかった．Δmet2，Δmet17で唯一変化が大きかったシスタチオニンは，全ての遺伝子破壊株で変化が見られることから，影響を受けやすい物質であることが示唆される．
　メチオニンは細胞内での存在量が少なく，生合成が遺伝子破壊で止められても培地中からメチオニントランスポーターにより取り込んでいる．よってメチオニンはどの遺伝子破壊株でもほとんど野生株と変化に差がなく，遺伝子破壊等に影響を受けることなく調節されていた．
　今回行った遺伝子破壊株を用いた実験では代謝経路が遮断されることはなかった．アイソザイムがないことは確認されているので，細胞外からの取り込みの他，他の代謝経路を経由して生成されている可能性が考えられる．
　全ての株において遺伝子発現パターンには野生株と違いがあるが，Δmet2とΔmet17においては代謝物の変化には違いがなかった．このことから，ホモセリンからホモシステインへと至る経路は遺伝子発現に依存していないことが分かった．
　HOM3，HOM6を破壊すると酵母の生育が著しく悪化し，遺伝子発現制御も正常なサイクルで行われていないことが明らかとなった．よって硫黄系代謝の制御を考えるにあたり，HOM3，HOM6，THR1の破壊は細胞に対する影響が大きいためターゲットとして適切でないが，MET2，MET17の破壊はほとんど野生株との違いがなかったため有効なターゲットとなりうることが明らかとなった．
　Δhom6は遺伝子発現量，代謝物量ともに，Δthr1は代謝物量の変化が野生株と大きく異なっていた．大腸菌ではスレオニンがΔhom3, Δhom6, Δthr1をフィードバック阻害していることが知られているが，酵母では特にΔhom6, Δthr1がスレオニンによるフィードバックに関与している可能性が示唆された．
　亜硫酸を高生産した株はΔhom6だけであり，HOM3とHOM6はほぼ同じ経路を遮断しているにも拘らず代謝も遺伝子発現パターンも違っていたことから，亜硫酸の制御の上でHOM6は重要な役割を果していると考えられる．
　今後はMET2，MET17，HOM6に注目しながら，硫黄代謝経路全体の流れを観察し，高亜硫酸，低硫化水素の代謝制御の可能性について研究を進めていく予定である．

6. 謝辞

　本研究を進めるにあたり細部に至るまで指導をしていただいた環境情報学部曽我朋義助教授に深く感謝致します．　ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社上野由希氏，先端生命科学研究所池田五月氏，斎藤菜摘博士には技術的なサポートをしていただいたことを感謝しています．
　最後にこのような研究の機会を与えてくださった環境情報学部冨田勝教授にこの場を借りて厚くお礼を申し上げます．

7. 参考文献

Hansen j, Kielland-Brandt MC. (1996) Nat Biotechnol., 14(11), 1587--1591

Olesen, K., Felding, T., Gjermansen C. and Hansen, J. (2002) FEMS Yeast Res., 2,563--573

Sugimoto, M., Kikuchi, S., Arita, M.,Soga, T., Nishioka, T., and Tomita, M. (2005) Anal. Chem., 77, 78--84

Sato, S., Soga, T., Nishioka, T., and Tomita, M. (2004) The Plant Journal, 40, 151--163

Soga, T., Heiger, DN. (2000) Anal. Chem., 72(6), 1236--1241

Soga, T., Ohashi, Y., Ueno, Y., Naraoka, H., Tomita, M. and Nishioka, T. (2003) J Proteome Res., 2, 488--494

Soga, T., Ueno, Y., Naraoka, H., Ohashi, Y. and Tomita, M. (2002) Anal. Chem., 74, 2233--2239

Thomas, D. and Sudrdin-Kerjan, Y. (1997) Microbiology and Molecular Biology Reviews, 61, 503--532

冨田勝監修. 斎藤輪太郎著 (2005) バイオインフォマティクスの基礎ゲノム解析プログラミングを中心に

EOF