2009年度森基金研究成果報告書

　脳という臓器は心とともに古くから様々なとらえ方をされてきたが，19 世紀の戦争による犠牲者の研究がより理解を進めたと言われている．近年では計測技術の発展により，低侵襲な脳機能計測が可能となり，医学だけにとどまらず分野を問わずに研究され，それらがもたらす知見は様々な分野で大いに期待されている．中でも磁気共鳴を用いた計測は非侵襲でかつ空間分解能が高く，磁気共鳴画像法は現在の臨床医学では欠かすことのできない画像診断方法の一つとなっている．しかし，一方で時間分解能が低いという欠点を持ち，脳機能研究においてもそのことが研究内容の幅を狭めているのが現状である．
　そこで我々は，磁気共鳴計測における撮像のタイミングを外部からの信号で制御することで，正確な時間で計測を実現する外部トリガー法という独自の手法を用い，一般的な磁気共鳴計測に比べ，より詳細な脳機能計測を試みた．磁気共鳴計測における実験内容・条件の検討を行った上で，機能的磁気共鳴画像法と核磁気共鳴スペクトロスコピーそれぞれにおいて外部トリガー法の適用し神経活動を血流動態と代謝物質の観点からとらえ，磁気共鳴計測における外部トリガー法の有効性を示すとともに，神経活動の新たな知見が示唆された．また，それらの結果を踏まえ，今後の研究・臨床における磁気共鳴計測を用いた実験方法やデータ解析方法についての考察を行った．

キーワード：　ヒト；脳；機能的磁気共鳴画像法；核磁気共鳴スペクトロスコピー；外部トリガー法

本研究の概要
　MR 計測装置は元来画像診断を行うMRI の使用を前提に作成されているため，一定時間で等間隔の撮像しか行うことができない．そのため，一般的な計測手法ではデータに誤差やアーチファクトを含むことが多く，時間のずれが生じてしまうことによってそれらを考慮した実験内容を考えなければならず，遂行できる実験に制限が課せられている．
　そこで我々は，MR 計測における撮像のタイミングを外部からの信号で制御することで，正確な時間で計測を実現する外部トリガー法という独自の手法を用い，一般的なMR 計測に比べより詳細な脳機能計測を試みた．
　MR 計測における実験内容・条件の検討を行った上で，外部トリガー法を用いたfMRI とMRS の計測を行い，MR 計測における外部トリガー法の有効性を示すとともに，神経活動の新たな知見を見いだすことを目的とし，また，それらの結果を踏まえ今後の研究・臨床におけるMR 計測を用いた実験方法やデータ解析方法についての考察を行った．

　本研究は埼玉県所沢市にある国立障害者リハビリテーションセンター病院において，医師・放射線技師の指導のもとに行い，被験者には説明と同意のもと計測を行った．

外部トリガー法
　MR 計測装置は元来画像診断を行うMRI の使用を前提に作成されているため，初期に設定した撮像間隔（repetition time，TR）に従った計測しか行うことができない．従って，一般のfMRI 計測では，図１に示すようなブロックパラダイムが用いられている．例えば視覚刺激を与える実験でこの撮像法を行う場合では，刺激画像を常に提示し続け，被験者が目の開閉を行うことで刺激提示（Task）と安静（Rest）が作られ，それぞれの有意差によって賦活部位を特定する．つまり，被験者は正確に開眼，閉眼をコントロールする必要がある．しかし，そのコントロール方法は「撮像回数を被験者が数えて目の開閉を行う方法」や「外部の実験者の指示により被験者が目の開閉を行う方法」といった人為的な方法しか用いられていない．そのため，両者共に時間的誤差が生じ，このズレが検査結果に大きな影響を与えてしまう．さらに前者は，被験者の注意を必要とし，疲れ等の要因が影響しアーチファクトが生じる原因とも成り得る．したがって，従来のブロックパラダイムにおいてこれらの時間的なズレにより時間分解能の向上は非常に難しい．
　そこで本研究機関ではこれらの時間的なズレを解消するために，MR 計測の撮像を制御する外部トリガーを用いた新たなシステムを提案した（以後，外部トリガー法）．このシステムは，MRI の撮像，刺激提示，目の開閉の合図といった検査に重要な要素を外部から制御することによりそれらの同期を取り，時間的なズレを最小限に抑えることができる．

図１．一般的なブロックパラダイム

　図２A のように，通常刺激提示システムとMR 装置は独立しているが，我々の提案する外部トリガー法は，MR 装置の撮像のタイミングを外部の刺激提示システムが制御し，研究者がMR 装置の撮像や音・画像などの刺激のタイミングを自由にデザインすることができる．通常の内部トリガーはTR に従って撮像を繰り返すことしかできないが，外部トリガーは刺激装置からのシグナルを受けると同時にMR 装置の撮像が行われるため，従来法に比べてより詳細に情報を取得することが可能であり，MR 計測による実験範囲を大幅に拡大することが可能となる．
　本研究機関では，この外部トリガー法を用いたMR 計測の研究が行われ，その有効性が示されてきたが，ごくシンプルな計測においてもその有効性を明瞭に判断できるのが図３である．この試行は同一被験者における計測で，TR3000ms のブロックデザインからなり，視覚刺激が始めの５スキャンに含まれている場合のBOLD 曲線の比較であるが，外部トリガーを用いた計測が正確な計測を可能にしていることが一目で把握することができる．
　また，fMRI における神経活動領域を推定するためのZ-Score 検定ではZ スコア1.96 を設定した場合，Z-Score が1.96 以上の領野が賦活したと判断されるが，これは信頼度95%以上で賦活時と安静時に有意な差が生じていると判断されることを意味する．通常用いられるZ スコアは1.96 （信頼度95%）かそれ以上であるが，外部トリガー法を用いた計測では，アーチファクトの少ない正確な計測から，Z スコア1.00（信頼度68.3%）程度で評価することが可能である．

図２．一般的な計測手法（A）と外部トリガー法を用いた計測手法（B）の比較

図３．一般的な計測手法（左）と外部トリガー法を用いた計測（右）において計測される視覚野のBOLD 曲線の比較

外部トリガー法のMRS への適用

視覚刺激による視覚野の代謝物質変化
　MRS を計測するにあたって，視覚野は両半球を含めて計測できるため，聴覚野や体性感覚野のように左右半球を考慮する必要がなく，解剖学的に位置の特定が容易である．また，視覚野は古くから様々な手法を用いて研究されているため，これまでの知識の集積が利用可能である．よって本研究は，それらの理由から対象を視覚野として計測を行った．また，複雑な要因が重なるのを防ぐため，単純な画像刺激としてコントラストに注目した．

背景と目的
　霧の中での運転や細かく色の薄い文章を見るときなど，コントラストが悪いと見づらいという経験をすることがある．しかし，ヒトは“もの”を見分けるために，明度・模様・形状・色差などの情報を元に，物体を背景から区別して認識することができる．
　ヒトの脳視覚野とコントラストの関係については，fMRI を用いた研究が多く行われており，コントラストを下げるに従って視覚野における賦活も低下することが知られているが，2006 年に発表されたGardner らのfMRI を用いたコントラスト順応に関する研究によると，従来得られていた結果と同様に，コントラストが悪くなるにつれて１次・２次・３次視覚野の賦活は低下するが，４次視覚野はコントラストが下がるにつれて賦活が見られ，ヒトが物体と背景の境界を検出する能力は４次視覚野が担っているのではないかと報告している．また，このコントラストに対する視覚野の研究において，近年，生体内における物質を測定する装置として注目されている MRS を用いた研究の報告はまだされていない．
　そこで本研究は，外部トリガー法を適用したMRS 計測により，健常者のコントラストに対する視覚野の応答を物質という観点からとらえることに試みた．さらに，血流量という観点から捉える既存のfMRI を用いた研究結果と比較することにより，ヒトの“もの”を見分ける機構の解明に向けた考察を行った．

ヒトの視覚野
　ヒトの後頭葉は１次視覚野（V１）や２次視覚野（V２）など視覚に関わる領域を含み，視覚野はブロードマンの脳地図における17 野と解剖学的に同等である．図３-１はヒトの脳における視覚野へ至る視覚情報の経路と視覚野の機能局在の模式図であるが，視覚情報は網膜から視交叉を通り，後頭葉に明瞭に見られる深い脳溝である鳥距溝の周囲に存在する１次視覚野に投射されている．それを囲むようにして２次視覚野，３次視覚野，下側に４次視覚野と高次行くに従って外側に存在する．
　ヒトの成人における１次視覚野の平均ニューロン数は，それぞれの大脳半球につき、約1 億 4000 万個ほどであると見積もられる(Leuba & Kraftsik, Anatomy and Embryology, 1994)．また，視野の中心が１次視覚野の外側に，視野の周辺は内側に投射されている．視覚野は後大脳動脈の鳥距溝枝から血液の供給を最も受け，fMRI 測定においても容易に計測が可能である部位とされている．

図４．ヒトの脳における視覚野へ至る視覚情報の経路と視覚野の機能局在（Logothetis NK: A window on consciousness より引用）

予備実験

実験内容の選定
　まず予備実験として，同一被験者における開眼時と閉眼時の２種類の安静時において視覚野の代謝物質に変化がないことを確認し，さらに，まばたきによる影響がないかを確かめた．そして，これらの結果を踏まえ以下のような３つの試行を考えた．

　① コントロールとして閉眼安静時（Rest）
　② 一般的な計測手法として連続刺激時（Endless）
　③ 外部トリガー法を用いた計測としての短時間刺激時（T125）

　これらの３試行において，鳥距溝を中心とした視覚野，ボクセルサイズ（20×20×20mm3）の代謝物質を測定した．用いた視覚刺激は視覚野の機能測定で一般的に使用される白黒チェッカーボードで，サイズは2 度（120 minutes of arc），4Hz（8 reversal / sec）の反転を行ったものである．
　測定における一連の流れ（以下シーケンス）については，刺激に対する撮像のタイミングを同期させた手法を用い，時間依存のあるMRS の計測を行った．一般的な測定では，画像刺激を常に提示し撮像を繰り返していく計測方法を用いて脳機能を評価している．このような計測方法は腫瘍判定など計測時に時間依存を考慮する必要がない場合は有効であるが，本研究のように健常者の脳における時間依存を考慮した計測においては適していない．このような計測に基づく試行として，試行②の連続刺激を行う．これはチェッカーボードが終始連続して提示されるもので，その間TR に従って撮像が行われるというものである（例：図５上段）．
　また，刺激に対する撮像のタイミングを同期させた外部トリガー法を用いた計測方法として試行③を考えた．このシーケンスは500 ミリ秒の視覚刺激後暗い状態が続き，はじまりから125 ミリ秒のところに撮像が入るというものである（例：図５下段）．この125 ミリ秒の撮像は，視覚誘発脳波のピークがP100 として知られ視覚刺激後100 ミリ秒にピークがくることと，チェッカーボードの4Hz の反転を考慮して設定した．
　さらに，MRS による測定では，得られる信号の強さが水分による信号に比べて弱く，安定した測定を行うために，１回の試行におけるデータの収集回数が重要となってくるため，予備実験として25，50，75，100，150 回を比較検証し，誤差の小ささと被験者への負担を考慮して100 回とし，TR は1500 ミリ秒で行った．

図５．視覚刺激のシーケンスデザイン　上）Endless：一般的なシーケンス下）T125：外部トリガーを用いたシーケンス

被験者
　被験者は，本実験に影響を及ぼすような眼科・神経疾患の病歴のない12 人の健常者（平均29 歳，範囲20－52 歳）に実験の説明と同意のもと協力していただいた．視力の弱い被験者は非金属製のレンズにより視力を矯正し，計測中における頭部の動きを避けるためにヘッドコイルとクッションを用いて被験者に負担にならない程度で補強を行った．各人１試行に対し１～３回の計測を行った．

結果
　上記の３試行３物質について，Tukey-Kramer’s HSD (honestly significant difference) test を行った後，閉眼安静時を元にDunnett’s multiple comparison test を行った結果，Cr とNAA に関しては３試行すべてにおいて有意差は見られなかった．また，Cho についても閉眼安静時と連続刺激において有意差が見られなかった．しかし，外部トリガー法を用いた刺激は他の試行に対してCho の約20％の減少がみられた（P＜0．01）．また，Cho/Cr，Cho/NAA，Cr/Cho，Cr/NAA， NAA/Cho，NAA/Cr といった各々の物質比も同様の結果に従った．

図６．各試行における３物質の平均と標準偏差（ErrorBar は標準偏差を示す）．

コントラスト刺激とシーケンスデザイン
　予備実験の結果は，MRS によるヒト脳視覚野におけるコリンの秒単位の変化をとらえたものであることを示唆し，一般的な手法ではとらえることが難しい代謝物質の変化をとらえたという外部トリガー法の有効性について示す結果となった．この結果を踏まえ、コントラスト刺激と実験のシーケンスデザインを決定した．短時間刺激開始125 ミリ秒後にCho の減少を観測することができたことから，このシーケンスデザインを用い，刺激画像のコントラストを変化させることにした．予備実験同様に，空間周波数（サイズ）2 度（120 minutes of arc），4Hz（8 reversal / sec）のチェッカーを使用した．そして，掲示画像は計測時間などを考慮し100・25・6.25％の３種類の刺激を用意した．図３-４に視覚刺激としたコントラストを変化させたチェッカーを示す．コントラストは最小輝度と最大輝度の差を意味し，コントラストを下げる程輝度の差が少なくなり，チェッカーの境界が不明瞭になっていく．全体の輝度は変化させることなくチェッカーを作成し，輝度による影響がないようにした．

図７．視覚刺激となるコントラストを変化させたチェッカー　左）100% 中央）25% 右）6.25％

計測条件
　MRS はスピンエコーシングルボクセルスペクトロスコピー（SVS）シーケンスを用い，自動・手動の両方でCHESS パルスとガウシアンフィルターによるシミング・水抑制の調節を行った．パラメータはTE=135msec，TR=2000msec，FOV240mm で計測した．１次視覚野を中心にボクセルサイズを20×20×20mm（= 8000 mm3）とし，100 回の撮像を加算平均したものを１試行と設定し，健常者４人に対し，閉眼安静状態（Rest）・コントラスト6.25%・25%・100%の４つの試行を計測した．被験者は，本実験に影響を及ぼすような眼科・神経疾患の病歴のないことを確認し，実験の説明と同意のもと協力していただいた．視力の弱い被験者は非金属製のレンズにより視力を矯正し，コントラストの変化に関係なくチェッカーの境が正常に見える状態で計測した．各人１試行に対し３回ずつの計測を行い，各試行計12 サンプルを得た．
　また，すべてのシーケンスはSTIM によってコントロールされ，実験時間は１シーケンスあたり約２分30 秒であった．統計解析はJMP（version6．0 for Windows， SAS institute Inc．）を用いた．

結果
　閉眼安静時・コントラスト6.25%・25%・100%の４試行における１次視覚野周辺のCho・Cr・NAA の３物質を表にしたものが図3-5 である．結果，Cr とNAA に関してはコントラストによる変化は見られなかったが，Cho はコントラストが下がるにつれてRest に近づくような結果となり，既存のfMRI の結果と類似した形状を見せた．予備実験とコントラスト刺激の実験によって変化を見せた物質はCho のみで，神経活動との相関が観察された．

図８．Rest（閉眼安静状態）とTask（コントラスト刺激３種類）の結果（縦軸は物質量，Error Bar は標準偏差を示す）

考察と展望
　コントラスト刺激に対して１次・２次視覚野におけるCho がfMRI とMRS の相関性を示した結果となった．また，光のない状態での閉眼と開眼による視覚野の物質の差は有意な差が見られないことが確認できているので，NAA とCr のRest とコントラスト刺激に対する有意差は眼の開閉には左右されていないことがわかる．このことにより，１次・２次視覚野においては，視覚情報が入力されるかされないかでCho に有意差がでることが示唆された．
　2006 年に発表されたGardner らの研究で報告されている，１次・２次・３次視覚野の賦活はコントラストに比例し，４次視覚野はコントラストが悪くなるにつれても賦活が見られる結果を考慮した上で本研究結果を考察すると，１次・２次・３次視覚野におけるCho はコントラストに比例している．４次視覚野に関しては，ボクセルの設定を正確に行う必要があるが，MRS 計測においてもコントラストが悪くなるにつれてCho の上昇が見られるのではないかと考えることができる．また，エネルギーという観点から，コントラストを悪くしていくにつれて Cr の増加が期待されたが，有意な差が見られなかったが，これについても４次視覚野においての変化が期待される．
　本研究では１次視覚野を中心にボクセルを設定し，１次・２次視覚野の計測を行ったが，各視覚野の境界は不明瞭で視覚的に判断できないため，各対象のみに絞った計測は難しく，また，４次視覚野にボクセルを置くことは解剖学上難しいため，ボクセルの位置・形状を変更することで各部位を評価することが可能かをさらに検討する必要がある．
　計測に関しては，コントラストによる脳内代謝物質の変化をみるためには，１人１回のみの計測で有意な差が得られるほど大きな差ではないため，１人に対する計測時間を考慮すると，計測による誤差を軽減させるため１人に対し数回計測することで，統計的に誤差を無くしていくことが好ましいと思われた．
　また，チェッカーの空間周波数を変化させることにより，より大きな差がみられるかどうかや，コントラスト順応に関する計測も，神経活動と代謝物質との相関性を考える上で重要な実験であることがわかった．
　現在までMRS 計測において一貫性が見られないのは，TR，TE，収集回数，ボクセルサイズ，水や脂肪の抑制など様々なパラメータ設定が必要で，各試行において適切なパラメータの検証が必要であることに起因していると思われる．このことは，予備実験としてのパラメータ検証の重要性を示しており，さらに，新たなデータの評価方法が必要とされていることを示している．そこでわれわれは，計測後のデータの後処理において，ノイズの多いデータを除去する方法についても検討し報告した（カーネル主成分分析を用いた核磁気共鳴スペクトロスコピーデータのノイズの評価と除去法，2008）．計測条件を一定にそろえることは難しいが，データの扱い方・評価方法に一貫性を見いだすことができれば，MRS の臨床における使用や装置の普及へと繋がっていくことが期待できる．
　未だ国内ではMRS を使用可能な施設が少ないが，新しい診断基準としての試行と代謝物質の変化の関係が明らかになることで，現在問題となっている詐病や高次脳機能に関する新たな評価方法としての解決手法としての可能性を十分に秘めている．しかし，それが達成されるには，さまざまな部位による基礎研究が必要不可欠であり，臨床的な研究だけでなく健常者の脳機能の解明が重要となる．そこには，刺激と撮像のタイミングを同期させる概念が非常に重要であり，詳細な時間依存の計測が必要である．
　また，fMRI やMEG，NIRS などの他の脳機能測定手法と組み合わせて計測することで，よりMRS の価値を見いだすことができる可能性もあり，価格の低下も含め，MR 機器の画像診断以外の価値がさらなる普及へとつながっていくと考えられる．
　外部トリガー法のMR 機器への適用は，これから解明されるべきさまざまな研究にたいして大いに貢献していくことが期待できる．

参考文献
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要旨

本研究の概要

外部トリガー法

外部トリガー法のMRS への適用

視覚刺激による視覚野の代謝物質変化

背景と目的

ヒトの視覚野

予備実験

実験内容の選定

被験者

結果

コントラスト刺激とシーケンスデザイン

計測条件

結果

考察と展望

参考文献