2009年度SFC研究プロジェクト補助 研究概要報告書

 

 

研究課題名

極限環境サンプルに由来するtRNA分子の網羅的解析

 

金井昭夫

慶應義塾大学環境情報学部・教授/ 同・先端生命科学研究所・教授

 

 

1.  研究の背景と目的

　tRNAは70-100塩基程度の小さいRNAであるが、特定のアミノ酸と結合し、mRNAに内在された遺伝暗号を蛋白質に変換するステップにおいて極めて根源的な役割を担う。一方で、レトロウイルス（例えばHIV）のDNA合成は特定のtRNAをプライマーとして開始されることが知られている。すなわち、tRNAはセントラルドグマの全てのステップにおいて役割を演じうることを示しており、もともとの遺伝情報はRNAレベルでの制御系によって担われていたとする「RNAワールド仮説」も考え合わせるならば、遺伝情報制御系の起源を研究する上で、tRNAはその要となる分子と考えることが出来る。

　ここで、進化的に原始の遺伝情報制御システムを残していると考えられるアーキア（古細菌）においても、真核細胞生物同様にイントロンを含むtRNAが同定され、また、2005年になると寄生型のナノアーキアNanoarchaeum equitansではtRNA遺伝子がゲノム上の異なる領域に断片としてコードされているという全く新しい事象が発見され、Split tRNAと名付けられた（RandauらNature (2005) 433, 537-541）。すなわち、アーキアのような種でtRNAや分断されたtRNAをゲノムレベルで同定、系統解析することで、遺伝暗号の成立に関わるような進化的に重要な知見をもたらすことが予想された。

　本研究では、地下の温泉源由来のサンプル（山形県鶴岡市の湯野浜温泉の泉源で地下250-1000mからくみあげた微生物サンプル）からtRNA分画を調製し、数万種の配列を得ることを最初の大きな目的に据えた。これらの極限環境にはアーキアをはじめとして、進化系統樹でその根元近くに位置する微生物が生息していることが多く、その大半の培養法は確立していないからである。我々はメタゲノム法（多様な微生物が共存したサンプルから培養を介さずに直接にゲノムDNAを調製し、その配列を網羅的に解読する手法）をRNAに応用し、環境サンプルから低分子RNA （tRNAを多く含む）分画を調製すると共に、cDNAライブラリーを構築し、次世代のシークエンサーにてその配列を決定した。

　

2.  研究成果

　サンプルは慶應義塾大学先端生命科学研究所がある山形県鶴岡市の湯野浜温泉源泉水を用いた。これは地下250～1000m から汲み上げられており，サンプリング時の温度は57℃、pH は8.1 であった。まず、3 リットルのサンプル水から遠心法により、そこに存在する微生物を濃縮し、培養を介さず直接に20-200 base程度の低分子RNA分画を調製した。これらのRNAに対し、オリゴRNAタグ（ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法で用いるプライマーの足場となる）を連結した後で、逆転写反応、PCRを行い、環境サンプル低分子RNA由来のcDNAライブラリーを構築した。このライブラリーを用いて、Roche 社の次世代シーケンサーGS FLX により、ライブラリーのインサートに対応する塩基配列を約8万種決定することが出来た。

　得られた配列をその長さや相同性を基準に分類することが出来た。その中には、これまでに配列の知られていない種に由来するtRNAや5S リボソーマルRNA (5S rRNA) が数多く含まれていた。また、アーキアよりもバクテリアが多く、2－3種が全体の約半分を、その他数十種が残りを構成していることが明らかとなった。また興味深いことに様々な位置で断片化されたtRNAが数多く見つかった。これらの結果の詳細について現在、学術論文としてまとめている（Murakami, S. et al. (2010) 投稿準備中）。

 

3.  本研究と関連した成果の発表

◎　学術論文

1.        Kanai, A., Sato, A., Fukuda, Y. Okada, K., Matsuda, T., Sakamoto, T., Muto, Y., Yokoyama, S., Kawai, G. and Tomita, M. (2009) Characterization of a heat-stable enzyme possessing GTP-dependent RNA ligase activity from a hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus furiosus.  RNA 15(3): 420-431.

2.        Fujishima, K., Sugahara, J., Kikuta, K., Hirano, R., Sato, A., Tomita, M. and Kanai, A. (2009) Tri-split tRNA is a transfer RNA made from 3 transcripts that provides insight into the evolution of fragmented tRNAs in archaea. Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106(8): 2683-2687.

3.        Sugahara, J., Fujishima, K., Morita, K., Tomita, M. and Kanai, A. (2009) Disrupted tRNA gene diversity and possible evolutionary scenarios. Journal of Molecular Evolution 69: 497-504. Review

4.        Kitamura, S., Fujishima, K., Sato, A., Tsuchiya, D., Tomita, M. and Kanai, A. (2010) Characterization of RNase HII substrate recognition using RNase HII-Argonaute chimeric enzymes from Pyrococcus furiosus. Biochemical Journal 426: 337-344.

5.        Murakami, S. et al. (2010) 投稿準備中

 

◎　学会、シンポジウム発表等

1.        村上慎之介、藤島皓介、奈須野恵理、松井求、中東憲治、杵島正洋、冨田勝、金井昭夫 (2009) 沖縄トラフ深海底土のメタゲノム解析から見た海洋性古細菌の多様性 第３回日本ゲノム微生物学会年会 東京

2.        S. Kitamura, K. Fujishima, A, Sato, D. Tsuchiya, M. Tomita and A. Kanai (2009) Characterization of RNase HII substrate specificity by using RNase HII-Argonaute chimeric enzymes in Pyrococcus furiosus. RNA2009, Wisconsin, USA.

3.        K. Fujishima, J. Sugahara, K. Kikuta, R. Hirano, A. Sato, M. Tomita and A. Kanai (2009) Tri-split tRNA: A novel type of transfer RNA produced from three transcripts via trans-splicing. RNA2009, Wisconsin, USA.

4.        J. Sugahara, K. Kikuta, K. Fujishima, N. Yachie, M. Tomimta and A. Kanai (2009) Bioinformatics on split and intron-containing tRNA genes in Archaea. RNA2009, Wisconsin, USA.

5.        K. Kikuta, J. Sugahara, K. Fujishima, R. Hirano, Y. Watanabe, S. Yoshinari, M. Tomimta and A. Kanai (2009) Stepwise splicing of pre-tRNAs containing three introns in a hyperthermophilic archaeon Thermofilum pendens. RNA2009, Wisconsin, USA.

6.        A. Kanai, A. Sato, Kosuke Fujishima and M. Tomita (2009) Systematic identification and characterization of archaeal DNA/RNA-binding proteins in Pyrococcus furiosus. Gordon Research Conference "Archaea: Ecology, Metabolism & Molecular Biology" Waterville Valley, NH. USA.

7.        K. Fujishima, J. Sugahara, K. Kikuta, A. Sato, M. Tomita and A. Kanai (2009) Split tRNA genes in a free-living archaeon provides deeper evolutionary understanding of the fragmented tRNAs in archaea. Gordon Research Conference "Archaea: Ecology, Metabolism & Molecular Biology" Waterville Valley, NH. USA.

8.        藤島皓介、菅原潤一、喜久田薫、平野麗子、佐藤朝子、冨田勝、金井昭夫 (2009) 超好酸好熱性古細菌Caldivirga maquilingensisにおける断片化したtRNA遺伝子群の解析 第22回　アーキア研究会 札幌 口頭発表

9.        K. Fujishima, J. Sugahara, K. Kikuta, A. Sato, M. Tomita and A. Kanai (2009) Discovery of Tri-split tRNA. The 10th International Conference on Systems Biology Stanford, California, USA.

10.      金井昭夫 (2009) ArchaeaにおけるシステマティックなRNA研究(System Biology of Archaeal RNAs and RNA-binding Proteins). 第80回日本生化学会大会 シンポジウム 神戸 招待講演、口頭発表

11.      A. Kanai (2009) System Biology of Archaeal RNAs and RNA-Binding Proteins. What is evolution?  Bicentennial of Charles Darwin's Birth, Kyoto, Japan. 招待講演、口頭発表

12.      J. Sugahara, K. Fujishima, K. Morita, M. Tomimta and A. Kanai (2009) Disrupted tRNA gene diversity and possible evolutionary scenarios. What is evolution?  Bicentennial of Charles Darwin's Birth, Kyoto, Japan. 口頭発表

13.      A. Kanai (2009) System biology of RNAs and their enzymes. Tsuruoka Proteomics Meeting 2009, Yamagata, Tsuruoka, Japan. 口頭発表

14.      K. Fujishima, J. Sugahara, M. Tomita and A. Kanai (2009) Evolution of tRNAs and their introns in Archaea. 第32回日本分子生物学会年会 ワークショップ 横浜 口頭発表

15.      A. Sato, M. Tomita and A. Kanai (2009) Biochemical characterization of a novel heatstable RNA 3’-terminal phosphate cyclase from a hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus furiosus. 第32回日本分子生物学会年会 横浜

16.      J. Sugahara, N. Yachie, K. Fujishima, M. Tomita and A. Kanai (2009) A possible model explaining the emergence of intron-containing tRNA gene by tRNA fusion via trans-splicing like reaction. 第32回日本分子生物学会年会 横浜

17.      K. Kikuta, J. Sugahara, K. Fujishima, M. Tomita and A. Kanai (2009) Analysis of stepwise processing of three introns-containing tRNAs in a hyperthermophilic archaeon Thermofilum pendens. 第32回日本分子生物学会年会 横浜

18.      K. Hamashima, J. Sugahara, M. Tomita and A. Kanai (2009) Comprehensive prediction of intron-containing tRNAs in Eukaryote. 第32回日本分子生物学会年会 横浜

19.      S. Murakami, K. Fujishima, J. Sugahara, M. Matsui, M. Tomita and A. Kanai (2009) Archaeal diversity in the Yunohama hot spring revealed by metagenomic analysis and their unique tRNA genes. 第32回日本分子生物学会年会 横浜

20.      K. Fujishima, J. Sugahara, M. Tomita and A. Kanai (2010) The Origin and Evolution of Disrupted tRNA Genes in Archaea. Asian Young Researchers Conference on Computational and Omics Biology 2010, Taiwan 口頭発表

 

4.  謝辞

　本研究で使用した湯野浜温泉源泉水（山形県鶴岡市）の採取にあたり、有限会社 湯野浜温泉源泉には大変にお世話になりました。心より御礼申し上げます。また、本研究は慶應義塾大学環境情報学部の村上慎之介君を中心に、同・先端生命科学研究所RNA研究グループの議論のもとに遂行されました。